天津工业生物所在新酶设计方法开发方面取得新进展----中国科学院天津工业生物技术研究所
酶作为生物催化剂具有反应条件温和、绿色环保等优点,但同时也存在催化底物类型有限、立体/区域选择性不高等缺点。因此,对天然酶进行设计改造,提升其工业应用属性,具有重要的基础研究意义及应用价值。近年来,定向进化(directed evolution)已被证明是行之有效的酶改造手段。然而,定向进化技术背后的科学规律仍然有待于进一步探索。酶之所以能够被人为进化,是因为它具有一定程度的可进化能力(evolvability);不同类型酶的改造难度并不一致,也从侧面反映了酶的可进化能力不尽相同。如何精准定位酶蛋白关键氨基酸残基位点,通过位点突变解锁其可进化能力并赋予人工酶新颖的催化特性,仍缺乏有效解决手段。
近日,中国科学院天津工业生物技术研究所(国家合成生物技术创新中心)Reetz大师工作室孙周通研究员带领的酶分子工程与工业生物催化研究团队开发了基于脯氨酸诱导的酶蛋白设计改造新方法(Proline-induced Loop engineering Test, PiLoT)。为验证PiLoT方法的可行性及优越性,选取醇脱氢酶TbSADH及其非天然潜手性酮底物为研究对象,通过PiLoT定位该酶远端位点的第84位脯氨酸残基(P84)为改造热点。经计算机虚拟突变分析及后续迭代突变实验,获得了催化活性及立体选择性均大幅提升的组合突变体P84S/I86L及ΔP84/A85G。吉布斯自由能的变化(ΔΔG)进一步表明突变体所增强的可进化能力是以降低稳定性的方式获得的。文章最后计算解析了P84位点突变诱导的催化口袋重塑以及相关突变体立体选择性催化的分子机制。
本工作通过探究酶可进化能力与稳定性之间的关联性,首次提出基于脯氨酸诱导的PiLoT方法,使改造热点的选取不再局限于酶催化口袋,并将该方法应用于醇脱氢酶的底物特异性及立体选择性改造,成功获得了可高效不对称催化还原双芳基潜手性酮底物的系列突变体。该工作为新型酶催化剂的设计开发提供了新工具。
该研究得到了国家重点研发计划等项目资助,相关结果已在线发表于SCI期刊Angewandte Chemie International Edition,天津工业生物所曲戈副研究员为论文第一作者,孙周通研究员为通讯作者。
PiLoT调控酶可进化性及稳定性示意图
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碳氮比的概念和优化方法
碳氮比(C/ N) :严格意义上应是指在微生物培养基中所含的碳源中的碳原子摩尔数与氮源中的氮原子摩尔数之比。(周德庆微生物学教程),在这里,我认为对于既能做碳源又能做氮源的物质应该及计算碳源又计算氮源。很多情况我们简单用培养基的碳源和氮源的比值来替代,但这是不准确的。另外由于一些培养基成分中的碳源不易利用,碳氮比也有用还原性碳源和粗蛋白之间的比值来替代,比如下式碳氮比的计算,就是用葡萄糖中的碳元素的摩尔浓度比上总蛋白中氮元素的摩尔质量浓度。
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染菌与控制是发酵圈永远绕不开的话题。降低染菌率是每一个发酵人应该认真学习和考虑的问题。而合理的应用灭菌、消毒和防腐方法是我们必备的技能。这也是我们在详细介绍发酵过程染菌防控之前需要介绍的内容之一。
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