微生物细胞对环境“逆”因素的适应与调控

↑ 点击上方“微生物发酵”关注我们，学习专业知识

微生物细胞工厂的生产效率是由菌株生长性能、产品合成能力和胁迫抗性共同决定的，其中增强微生物细胞工厂的胁迫抗性是关键。耐受性工程基于微生物细胞工厂抵御胁迫压力的应激反应机制，通过巩固壁膜屏障增强胁迫防御能力，加快应激反应提高损伤修复能力，创制耐受进化工具筛选鲁棒性增强的工业微生物。

【发酵工艺】工业微生物生物鲁棒性及育种

一、发酵工业中涉及到的“逆”因子

(1) 生理功能负担，外源路径引入导致的细胞翻译负担、代谢通量负担、内环境负担等；

(2) 底物胁迫，如葡萄糖、木糖等和由木质纤维素水解得到的抑制物 (乙酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛、酚类衍生物等)。此外，底物的加入通常会改变微生物的胞外微环境，如造成高渗胁迫等；抑制物等有毒物质还会对微生物产生毒性进而抑制正常的生理代谢；甲醇等底物会直接抑制菌体的生长；

(3) 中间代谢物/终产物胁迫，代谢物胁迫主要来源于醇类等疏水性较强的物质，或者有机酸和氨基酸等亲水性代谢物，这些代谢物的不断积累导致微生物胞内外微环境剧变、微生物细胞壁膜组分/功能受损；

(4) 环境压力包括胞内微环境 (酸胁迫、氧胁迫等)和胞外微环境(盐胁迫、温度胁迫、压强胁迫等)。

二、微生物的应对措施

（1）细胞壁，改变细胞壁的性状和组成来保证细胞的完整性和抗逆性。细胞通过调节细胞壁的厚度和合成速率，激活细胞壁完整性信号通路重构细胞壁的结构抵御胞外应激。此外肽聚糖对细胞抵抗外部环境有着重要的作用。

（2）细胞膜，微生物细胞膜对内外因子的运输具有选择性和可调节性，细胞膜在维持细胞功能上作用远远大于细胞壁，因此细胞膜成为胁迫防御工程更为关键的调控靶点。

膜脂是细胞膜的基本组成成分，由磷脂、甾醇和鞘脂组成，因此工程化细胞膜脂质策略包括：修饰磷脂组成(磷脂头部磷酸基团、磷脂尾部脂肪酸链)优化甾醇比例和调节鞘脂含量。

膜蛋白：细胞膜通透性涉及对离子、营养物质和有毒物质的选择透过性，这些物质的跨膜运输主要通过膜孔和膜蛋白的介导。通过对细胞进行改造，增强或者减弱微生物对某种物质的转运效果，即可实现提高抗逆性目的。例如：对于胞外亲水性产物的胁迫，过表达 S. cerevisiae C4-二羧酸转运蛋白 ScMae1(p) 使琥珀酸、苹果酸、富马酸产量分别提高了 3 倍、8 倍、5 倍，过表达 AcDct(p) 使苹果酸的产量提高了 12 倍。

（3）损伤修复

当细胞壁和细胞膜不能抵挡“逆”因素时，微生物就会启动自身的修复机制，来应对损伤。修复可以发生在DNA复制，转录，翻译，折叠加工，代谢等各方面。各类因子和蛋白在其中发挥了重要作用。

转录因子：转录因子是一类能够调节基因表达速率的DNA 结合蛋白，能保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达。特异性转录因子可调控微生物细胞工厂应对底物胁迫。例如的转录因子 KmHsf1 和 KmMsn2 促进了 K. marxianus在高温下的细胞生长和乙醇发酵；转录因子AnCrz1 调节激活钙调磷酸酶基因表达，可促使构巢曲霉 (Aspergillus nidulans) 耐受碱性 pH条件和细胞外高浓度的钙离子。

特异性调节蛋白：微生物细胞工厂还可通过确保特定蛋白质的优先合成来修复损伤，蛋白活性调控 (如修饰激活/失活降解/定位改变等) 往往能快速地响应外界环境变化，促进应激相关特异性调节蛋白的表达。如热休克蛋白 (heat shock protein, HSP) 。特异性调节蛋白为核心的酶修复体系也在损伤修复工程中发挥着重要作用，典型代表为超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)，通过清除机体内·O2−来保护细胞；过氧化氢酶可以促使 H2O2 分解，清除细胞内的 H2O2。

代谢物：新陈代谢不仅为微生物提供能量和关键结构成分，还提供一些关键的胁迫响应代谢物。非酶防御体系中压力缓冲代谢物 (包括谷胱甘肽、硫氧还原蛋白、维生素 C、赖氨酸和NADH/NADPH 等) 可作为还原剂清除自由基(超负阳离子、羟自由基、有机自由基、有机过氧基等) 的小分子，调节这些压力缓冲代谢物的细胞内浓度可以在代谢物水平上修复损伤，提高微生物细胞工厂的抗逆性。

三、微生物进化策略

耐受进化工程是指利用微生物基因组的可塑性，微生物种群在一定选择压力条件下不断进化，通过精密的调控机制与复杂的抵抗策略使微生物进化以生存和适应多种胁迫压力，获得有益突变的方法，可用于改善微生物细胞生长，提高化学品的浓度、得率和生产强度，发现未知的生物调控机制。

非理性耐受进化工程 ：传统的工业微生物育种、基因组改组、ALE。

适应性实验室进化技术在微生物育种中的应用进展

半理性耐受进化工程：利用系统生物学和合成生物学的方法，以序列模块化和元件化进行组装，同时结合自动化和高通量分析手段，对工业微生物开展从全基因组尺度进行系统的、全局的、多位点的扰动，多次迭代，以达到快速积累多样性基因型突变并获得期望的表型。该策略一般是在明确其抗逆机理的基础上开展的。