脂肪酶高产菌株高通量筛选方法的建立（案例讲解）

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样品的好坏对筛选效果的影响巨大，要想获得较优秀的菌，首先样品中要有一定的概率含有你的目标菌株。为了实现这个目的，我们可以通过采取定向富集、诱变等手段，具体的课参考以下视频介绍方法。

发酵工程视频-菌种与育种-7样品预处理

在该案例中，采取  ARTP 诱变来使得样品中菌株发生正向或者负向突变。正向突变菌株就是我们所需要的目标菌株。诱变育种的关键是控制合适的致死率，当致死率在 90% 以上时菌株产生正突变的概率相对较高，并且在此致死率下回复突变的概率更小。

ARTP是常压室温等离子体（Atmospheric and Room Temperature Plasma）的简称，能够在大气压下产生温度在25-40 °C之间的、具有高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）浓度的等离子体射流。

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在获得诱变样品后，我们需要一个快速的识别方法，在“高通量筛选方法的建立及应用”中提到高通量筛选方法的信号检测策略有荧光检测，拉曼光谱检测，风光光度计，颜色圈，透明圈，菌落大小，抑菌圈等。我们需要我们所筛选的菌株和产品进行设计。

该案例中所采取的方法是分光光度计（酶标仪）的方法，采取该方法就必须建立一种和酶活性大小有一定相关性的显色方法。脂肪酶活性检测原理如下：

以橄榄油为底物，经脂肪酶水解后生成游离的脂肪酸，脂肪酸与 CaCl2 反应生成钙盐沉淀（皂化反应）和盐酸，然后通过溴麝香草酚蓝和苯酚红两种 pH 指示剂进行显色，并在 630 nm 处有最大的吸收峰。

很大一部分酶制剂通过直接或者间接的方法都能获得有效的颜色反应，可与用于酶活性检测和快速筛选方法的建立。

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在确定信号检测策略后，就可以设计高通量的筛选方案了，一般颜色反应可以考虑平板颜色全的方法、多孔板高通量筛选方法和基于流式细胞仪的筛选方法。

在该案例中所筛选的目的菌是米曲霉，流式细胞仪的方法不适合选取。而丝状真菌的特性决定了平板筛选策略建立的困难性。该案例采取微孔板来作为粗筛工具，也同样具有挑战性：

• 丝状真菌生长后，孔板中会形成致密的菌丝体，而且发酵液体积减少严重，这样的生长状态不宜进行筛选。见下图左侧。

• 对溶氧有一定的需求。

针对以上情况，作者通过减少培养基营养成分，优化pH，优化装液量，优化加入玻璃珠的数量等方法，达到了理想的效果。

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1.诱变育种，需要制备孢子悬液，确定诱变育种条件。

2.初筛，高通量筛选一般指初筛方法，需要建立高效的粗筛方法。一般可分为培养和检测两部分，在该案例中：①培养，确定具体培养方法后（多大微孔板，培养基，什么条件，玻璃珠等），经由 ARTP 诱变，将诱变完的孢子悬液直接接入灭菌的 24-MTPs，每孔 20 μL，（保证每孔含有约 30~40 个孢子），装液量为 2.0 mL，并在 28 ℃，150 r/min 条件下培养 4 d。 ②检测，初筛培养 4 d 后，孔板中每孔吸取 50 μL 的上清液，稀释适当的倍数。将 20 μL 双指示剂，80 μL CaCl2 溶液加入 96 孔酶标板后，再加入现场配

好的橄榄油底物。放入孔板振荡培养箱中 37 ℃ 预热 5 min，再迅速加入稀释好的酶液 20 μL，反应 15 min，迅速放入酶标仪中，在 630 nm 处测量吸光度。

3.复筛，选取初筛效果好的菌株进行复筛验证，进一步筛选。

4.菌株保藏。

上述方法视乎仍然非常麻烦，多孔板之所以能称之为高通量筛选方法，主要是因为他能实现标准操作，甚至自动化操作。