蛋白含量/氮含量测定方法及其适用对象

方法

灵敏度

时间

原理

优缺点

适用范围

凯氏定氮法（Kjedahl法）

灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％

费时 8～10小时

将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定

干扰较少，非蛋白氮会干扰有机氮的测定（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）

用于标准蛋白质含量的准确测定；凯氏定氮法被国内外视为蛋白质含量的标准检验方法，可作为衡量其他蛋白质含量检测方法准确性的标准。干扰少；费时太长，不可测硝肽氮。

双缩脲法（Biuret法）

灵敏度低1～20mg

中速 20~30分钟

多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物

干扰少，灵敏度低。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。适用于快速氮不准确的蛋白含量测定。

紫外吸收法

较为灵敏50～100mg

快速 5～10分钟

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共扼双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，进行蛋白质含量的测定。

受各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸的干扰

适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

Folin－酚试剂法（Lowry法）

灵敏度高～5mg

慢速 40～60分钟

双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原

受硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇的干扰。耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化

同双缩脲法

考马斯亮蓝法(Bradford法)

1～5mg

快速5～15分钟

考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm

强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS

游离氨基酸、肽和低分子量蛋白质不会与考马斯染料试剂产生颜色。一般情况下，肽或蛋白质的质量必须大于 3,000 道尔顿才能被该试剂检出。在某些应用中，这是一个优点。

BCA法

0.5-20μg/mL

BCA法基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，BCA鳌合Cu+作为显色剂，产生蓝紫色并在562nm有吸收峰，单价Cu+与蛋白质呈剂量相关性。

不易受一般浓度去污剂的干扰；抗干扰能力强。可受螯合剂，高浓度还原剂的影响。

单个氨基酸和二肽在双缩脲反应中不受影响，但三肽以及更大的多肽或蛋白质会发生反应，产生吸收峰位于 540 nm 的淡蓝色至篮紫色复合物。一个二价铜离子与附近四到六个多肽结合形成有色螯合物。产生的颜色强度与参与反应的肽键数目成正比。

杜马斯定氮

3-5min

样品在高纯氧中充分燃烧的过程中，将氮元素转化为氮气或氮氧化物，再经过高温铜的还原，使所有的氮转化为 N 2 ，然后利用热导检测器检测 N 2 的含量来推算样品中氮含量。因此杜马斯定氮法也称为杜马斯燃烧法或燃烧定氮法。

快速，简洁

杜马斯燃烧法既能将有机氮转化为N2 ,又能将无机的硝态氮转化为 N 2。 国家标准GB5009.5-2016中规定 杜马斯定氮法仅适用于蛋白质大于10g/100g的固体样品。