【发酵工艺】有害菌防控-发酵染菌检测方法及技术手段
染菌与控制是发酵圈永远绕不开的话题。降低染菌率是每一个发酵人应该认真学习和考虑的问题。而有效的检测和判断手段是我们发现染菌的前提。
染菌判断是我们在发酵过程中首先面临的问题，我们怎么知道发酵系统染菌了？什么时候染菌的？染菌到什么程度了？越是早发现，对事故处理越是有利。
一切异于常规规律的状态都可能意味着染菌。对于发酵工艺已经稳定的品种，要明察秋毫，对于新品种或者工艺正在调整的品种要抓主要规律。
纯种培养和发酵，在外界条件（种子培养情况，接种量，通气，温度，培养基，补料等）一定的情况下，发酵系统是趋于稳定的。比如溶氧，pH变化（酸碱消耗速度），补料消耗速度，蛋白某时刻的表达量等参数的变化规律。因此如果这些我们常规见到的一些参数出现了异常，那么我们就要考虑染菌的可能性。
摇瓶条件下是非常难以判断种子是否染菌的，所以在做摇瓶种子液是最好能加入一定量的抗生素，以减少染菌的可能性。
但是我们还是要对其中的非常明显的异常情况多加留意：培养液出现异常，比如出现不应该有的结块，出现不应该有的菌丝，颜色有明显的异常，外测pH异常，生物量跟踪监测发现异常等。
不同种类的发酵过程所发生的发酵异常现象，形式虽然不尽相同，但均表现出菌体生长速度缓慢、菌体代谢异常或过早老化、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液颜色的异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的黏度异常增加等。
在发酵罐培养过程中，我们会定时取样，测定其生物量。在我们工艺稳定的情况下，固定发酵时间的生物量是趋于稳定在一个范围的，如果发现生物量出现较大的偏差，在排除其他条件的影响的情况下，就要考虑染菌的可能性。比如大肠杆菌在培养的时候出现生物量极具下降，那么染噬菌体的可能性就非常大。
pH值变化是所有代谢反应的综合反映，在发酵的各个时期都有一定规律，pH值的异常变化就意味着发酵的异常，比如我们在做大肠杆菌发酵的过程中采取pH反馈补料的时候，发现补料速度变慢，那么就有可能是出现了染菌的情况。
发酵系统溶氧的变化是非常灵敏的，我们在常规的发酵程序中，溶氧都是在固定的时间降低到某个值，同样，如果我们利用溶氧做反馈控制，就反应到物料的补加速度上。对于特定的发酵过程要求一定的溶解氧水平，而且在不同的发酵阶段其溶解氧的水平也是不同的。如果发酵过程中的溶解氧水平发生了异常的变化，一般就是发酵染菌发生的表现。在正常的发酵过程中，发酵初期菌体处于适应期，耗氧量很少，溶解氧基本不变；当菌体进入对数生长期，耗氧量增加，溶解氧浓度很快下降，并且维持在一定的水平，在这阶段中操作条件的变化会使溶解氧有所波动，但变化不大；而到了发酵后期，菌体衰老，耗氧量减少，溶解氧又再度上升；当感染噬菌体后，生产菌的呼吸作用受抑制，溶解氧浓度很快上升。发酵过程感染噬菌体后，溶解氧的变化比菌体浓度更灵敏，能更好地预见染菌的发生。
由于污染的杂菌好氧性不同，产生溶解氧异常的现象也是不同的。当杂菌是好氧性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直到接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好氧性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。
不同的微生物呼吸代谢途径会有差异，因此尾气中二氧化碳或者氧气的成分会有差异，当尾气中的成分浓度发生改变，也要注意是否染菌。对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中C02含量的变化是规律的。染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排气中C02含量的异常变化，如杂菌污染时，糖耗加快，C02含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，C02含量减少。因此，可根据C02含量的异常变化来判断是否染菌。
一般在发酵过程中泡沫的消长是有一定的规律的。当发酵后期染噬菌体后，噬菌体会导致细胞裂解，蛋白释放，从而导致泡沫突然增加。
不同的菌株、生产不同的产品发酵液的味道是不一样的，经验丰富的员工可以通过味道的异常来警示发酵系统染菌。
宏观判断不需要借助特殊的设备和一起，仅有到发酵常配的检测设备，但是宏观判断并不能确定是否染菌，需要进一步借助微观方法来给出结论。
染色方法分为很多种，我们常用的就是单染色法和革兰氏染色，可以满足我们常规的镜检判断要求，当然，如果有必要的时候可以进行鞭毛染色和芽孢染色。染色我们看什么？
①菌体形态，是否有异于生产菌株的形态，比如我们生产菌株是酵母菌，而视野中有杆菌，哪怕就那么一个。我们的生产菌株是芽孢杆菌，而视野中出现了球菌.我们生产菌株是丝状菌，但是我们视野中有其他类型的菌。
②菌体状态，菌体经过染色后是否饱满，如果染色很浅，或者发现视野有明显碎片，那么就要考虑噬菌体的可能性。
③正常的异常情况，比如枯草芽孢杆菌在快速增值时，会在视野中出现长链状，这并不一定是染菌。
将待测样品在无菌平板上划线，分别于37℃和27℃进行培培养，一般24h后即可进行镜检观察，检査是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可将需要检査的样品先置于37℃培养6h,使杂菌迅速増殖后再划线培养。
噬菌体平板检测法：采用双层平板法、滤纸片法、点样法等。
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平板划线和肉汤培养要做至少三个重复，并且连续做三次，以排除人为操作误差。如果连续三次出现浑浊或者变色可以确定染菌
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总原则：科学合理的选择检查工序和时间，避免下道工序再遭到污染。取样方法和设备要科学合理，避免操作染菌。分工序和分时间进行取样检查。具体时间安排可参考下表：
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碳氮比（C/ N） ：严格意义上应是指在微生物培养基中所含的碳源中的碳原子摩尔数与氮源中的氮原子摩尔数之比。（周德庆微生物学教程），在这里，我认为对于既能做碳源又能做氮源的物质应该及计算碳源又计算氮源。很多情况我们简单用培养基的碳源和氮源的比值来替代，但这是不准确的。另外由于一些培养基成分中的碳源不易利用，碳氮比也有用还原性碳源和粗蛋白之间的比值来替代，比如下式碳氮比的计算,就是用葡萄糖中的碳元素的摩尔浓度比上总蛋白中氮元素的摩尔质量浓度。
넶2990
2021-09-09
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Km、 Kcat、Vmax之间到底啥关系
넶1196
2021-10-26
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染菌与控制是发酵圈永远绕不开的话题。降低染菌率是每一个发酵人应该认真学习和考虑的问题。而合理的应用灭菌、消毒和防腐方法是我们必备的技能。这也是我们在详细介绍发酵过程染菌防控之前需要介绍的内容之一。
넶672
2020-04-29
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↑ 点击上方“微生物发酵”关注我们微生物菌种的改造是现代微生物发酵行业中，提高其工业化生产性能，提高酶和菌的
넶629
2021-09-17
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MRS培养基的组织成分：
넶600
2020-04-07
