天津工业生物所开发枯草芽孢杆菌高效蛋白表达与途径调控系统-

　　枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为革兰氏阳性菌的模式菌种，具有分泌表达、异源表达水平高和生物安全等诸多优良特性，广泛应用于淀粉酶、蛋白酶等多种工业蛋白质的表达和维生素、核苷等重要化学品的生产中。目前商业化枯草芽孢杆菌表达系统匮乏，且表达强度与大肠杆菌T7表达系统和毕赤酵母细胞甲醇诱导表达系统差距较大，同时还存在诱导物毒性、诱导物价格昂贵等问题，限制了枯草芽孢杆菌在工业化生产中的应用潜力。 

　　中科院天津工业生物技术研究所张大伟研究员团队在枯草芽孢杆菌中开发了具有自主知识产权的基于麦芽糖转录激活因子操作子（MalO）的基因表达调控系统MATE（maltose-inducible expression system），实现了目标基因的高强度、高严谨表达与调控。   

　　枯草芽孢杆菌高效蛋白表达调控系统的构建策略及其在途径调控、合成生物技术应用如下： 

　　（1）通过对麦芽糖启动子P_malA的操作子序列（MalO）进行鉴定、突变和高通量筛选，获得了一系列具有不同强度的启动子突变体，并通过对MalO序列在启动子中的位置和序列进行调整，构建了在单细胞内能够兼容的诱导激活型/抑制型系统MATE-ON/OFF，并通过流式细胞仪证明MATE诱导系统具有高均一性和高重复性。 

　　（2）通过对启动子cre元件和宿主细胞的工程改造，解除了葡萄糖对系统的CCR抑制效应，实现20g/L葡萄糖条件下维持原本诱导表达强度。 

　　（3）通过加入激活型核糖开关整合转录-翻译调控元件，进一步提高系统严谨性，在保持表达强度的条件下实现790倍的诱导倍数，实现了系统强度和系统严谨性的兼得。 

　　（4）分析了MalO在不同数量和距离下对启动子强度的影响，通过改变MalO在启动子中的数量或位置可实现对启动子强度的减弱或增强，提供了一种获得不同梯度强度启动子元件的新策略。同时证实了MalO作为转录增强子对其他内源启动子的诱导激活作用，并以α-淀粉酶和hFGF21为例验证了MalO增强子在激活分子伴侣、促进目标蛋白质表达上的应用。 

　　（5）利用MATE系统实现了hFGF21、几丁质酶、阿洛酮糖异构酶、低聚半乳糖苷酶、甘露聚糖酶等9个异源蛋白质的高效分泌表达，胞内蛋白平均表达水平近60%，胞外蛋白平均表达水平近80%。 

　　（6）通过合成生物学策略，构建MATE-on/off开关系统，调控细胞分裂和细胞形态，也可高效调控合成途径实现高产紫杆菌素等营养化学品。证实了MATE作为基因开关和途径调控工具在基因功能研究及合成生物学中的应用能力，为枯草芽孢杆菌提供了一种新的高效蛋白表达系统和代谢途径调控工具。  

　　该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金项目、天津市合成生物技术创新能力提升行动项目的支持，相关成果发表在期刊Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)。天津工业生物所付刚副研究员为论文的第一作者，中科院天津工业生物技术研究所Sang Yup Lee教授和张大伟研究员为论文的共同通讯作者。

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枯草芽孢杆菌高效MATE表达调控系统的构建和应用