【发酵基础】培养基的成分之氮源
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在微生物产品的发酵生产和科研工作中,由于菌种不同,菌种的生长阶段不同以及发酵工艺条件的差异,所使用的的培养基也不同,培养基的原材料归纳起来有碳源,氮源,无机盐和微量元素、水、生长因子和前提等。
氮源是指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。它是微生物发酵中使用的主要原料之一。其主要功能是构成微生物细胞和含氮的代谢产物,当培养基中碳源不足时,可作为补充碳源。常用的氮源有有机氮源和无机氮源两大类。黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、菌丝体和酒糟等都是有机氮源。无机氮源有氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等。
有机氮源除含有丰富的蛋白质、肽类、游离的氨基酸以外,还含有少量的糖类、脂肪、无机盐和生长因子等,是较理想的营养物质。微生物在有机氮源的培养基中,可以直接利用游离氨基酸或其他有机化合物的碳架,合成用于构成细胞的蛋白质和其他细胞物质。
微生物对氨基酸的利用是有选择性的,如缬氨酸既可用于红霉素链霉菌的生长,又可以氮源的形式参加红霉素的生物合成。在螺旋霉素发酵中,发培养基里加入L-色氨酸可使螺旋霉素的产量显著提高,但L赖氨酸则完全抑制螺旋霉素的生物合成。另外,有机氮源中含有的某些氨基酸是菌体合成次级代谢产物的前体。如a-氨基己二酸、半胱氨酸和缓氨酸是合成青霉素和头孢菌素的直接前体,玉米浆中含有的苯乙胺和苯丙氨酸有合成青霉素G的前体作用。色氨酸是合成硝吡咯菌素和麦角碱的前体。蛋白胨等有机氮源的成分较复杂,加上产地、加工方法的不同,其质量不稳定,常是引起发酵水平波动的主要因素。因此,在选择有机氮源时要注意品种、产地、加工方法对质量的影响,注意它们与菌体生长和代谢产物生物合成的相关性。
黄豆粉是发酵工业最常用的有机氮源。根据油脂含量可将其分为三种,全脂黄豆粉(含油脂18%以上),低脂黄豆粉(含油脂9%以下),脱脂黄豆粉(含油脂2%以下)。各种黄豆粉的组成见表1。棉籽粉也是应用较广泛的有机氮源,它有两种产品,一种是低温提取油脂后加工制备的,称为 Pharmamedia;另一种是在高温下提取油脂后加工制备的,称为 Proflo,两种棉籽粉的成分组成见表2。棉籽粉在青霉素等几种产品的生产中,应用的效果很好。
表1 黄豆粉的组成成分
组分(%) | 脱脂黄豆粉 | 低脂黄豆粉 | 全脂黄豆粉 |
蛋白质 | 48.60~52.80 | 46.31~40.63 | 33.75~38.00 |
油脂 | 0.43~1.59 | 3.99~14.40 | 19.54~20.46 |
灰分 | 5.88~7.20 | 7.34~5.10 | 4.52~4.81 |
水分 | 6.17~9.48 | 11.00~4.7 | 8.84~9.29 |
表2 棉籽粉的组成成分
玉米浆、麩质粉是玉米淀粉生产过程中的副产物。国际上将一种优质玉米浆称为 Solulys L。生产中应用的玉米浆有干玉米浆和液态玉米浆(干物质约占50%)两种。由于它们的质量波动较大,因而应用受到限制。两种玉米浆的组成见表3。玉米浆成分的不稳定性是我们在利用玉米浆时必须面对的问题。生产原料工艺控制、生产季节及玉米浆的储运等因素均会造成玉米浆成分的改变,对微生物发酵产生较为明显的影响。
表 3 玉米浆的组成成分
组成成分 | g/100g液体玉米浆 | g/100g干玉米浆 |
干物 | 46.8~49.6 | 90.4~91.7 |
灰分 | 8.0~10.4 | 12.9~13.7 |
总氮 | 3.3~3.7 | 7.4~8.3 |
总糖 | 0.8~4.4 | 5.7~5.9 |
酸度ml(0.1molNaOH)/L | 108.0~144.0 | 149.0~198.0 |
挥发酸ml(0.1molNaOH)/L | 0.1~1.1 | 0.5~1.35 |
乳酸 | 11.6~19.3 | 15.1~17.7 |
pH | 4.0~4.7 | 3.2~4.4 |
磷 | 1.5~1.9 | 2.6~2.8 |
钙 | 0.02~0.07 | |
钾 | 2.0~2.5 | |
沉淀固态 | 38.4~52.0 |
表4 玉米浆中氨基酸含量
氨基酸 | 液体(占总N%) | 固态(占总N%) |
天门冬氨酸 | 5.5 | 5.56 |
苏氨酸 | 4.0 | 4.5 |
丝氨酸 | 4.6 | 3.6 |
谷氨酸 | 17.5 | 14.0 |
脯氨酸 | 8.0 | 10.0 |
甘氨酸 | 5.1 | 6.1 |
丙氨酸 | 11.2 | 11.7 |
缬氨酸 | 5.8 | 6.2 |
胱氨酸 | 1.9 | 2.2 |
蛋氨酸 | 1.9 | 2.1 |
异亮氨酸 | 3.6 | 3.6 |
亮氨酸 | 11.3 | 9.5 |
酪氨酸 | 3.4 | 2.8 |
苯丙氨酸 | 4.4 | 3.75 |
赖氨酸 | 2.5 | 3.0 |
组氨酸 | 2.8 | 3.7 |
精氨酸 | 3.3 | 4.0 |
花生饼粉为纯白无味的物质,添加入食品中可以提高食品的营养价值,还可以保持食品的原有风味,已被直接用于饲料及食品涂料。在利用微生物生产 α -淀粉酶时,花生饼粉被视为最佳有机氮源,无论是利用枯草芽孢杆菌 还是米曲霉生产 α-淀粉酶,以花生饼粉为氮源得到的淀粉酶的活力最高。
蛋白胨、酵母粉、鱼粉等也是工业发酵常用的有机氮源。蛋白胨多由动物组织和植物(酸或酶)水解制备的。由于加工用的原材料和加工方法的不同,制备的蛋白胨中的氨基酸品种和含量差异较大,见表5。由于它的质量不大稳定,也是引起发酵水平波动酵母粉(或酵母浸汁)含有蛋白质、氨基酸、维生素等,主要来源于的主要因素之啤酒酵母和面包酵母。它的质量随酵母品种而异,见表7。商品鱼粉含有60%左右的粗蛋白,12%左右的油脂,4%~5%的氯化钠。在某些品种的生产中还使用蚕蛹粉、石油酵母、菌体蛋白等做氮源的。
表 5 各种水解蛋白的组成
在发酵过程中,酵母浸粉和蛋白胨已被视为必需营养物质,为达到最佳发酵效果,两者总是会搭配使用。酵母浸粉蛋白分子与蛋白胨分子相比较小,水解物分子量介于月示 和肽之间,小分子的酵母浸粉有利于菌体吸收,促进菌体生长,蛋白胨的使用则利于产物稳定期的延长,促进产物代谢,大分子蛋白质有利于刺激蛋白的表达,促进产物代谢。
表 7 酵母浸提物的组成
生产中使用的无机氮源,成分单质量较稳定。铵盐中的氮(三价的)与细胞中有机氮化合物中的氮处于相同的氧化水平,可被菌体直接吸收利用。硝酸盐中的氮原子必先还原成氨后,才能被菌体吸收利用。它们都是易被菌体利用的氮源。氨氮和硝基氮经菌体同化后,分别产生酸性和碱性物质,从而改变培养液的pH值,如
反应生成的NH3被菌体用于氮代谢,产生的酸性或碱性物质引起发酵液pH变化。凡是代谢后能产生酸性物质的营养成分叫生理酸性物质,如硫酸铵。凡是代谢后能产生碱性物质的营养成分叫生理碱性物质,如硝酸盐、乙酸钠等。在培养基中加入适量的生理酸性物质和生理碱性物质,可以调节发酵液的pH值。
二、氮源的种类和浓度的影响和控制
如前所述,氮源有无机源和有机氮源两大类。它们对菌体代谢都能产生明显的影响,不同的种关和不同的浓度都能影响产物合成的方向和产量。如谷氨酸发酵,当NH4+供应不足时,就促使形成a酮戊二酸;过量的NH4+,反而促使谷氨酸转变成谷氨酰胺,控制适当量的NH4+浓度,才能使谷氨酸产量达到最大。又如在研究螺旋霉素的生物合成中,发现无机铵盐不利于螺旋霉素的合成,而有机氮源(如鱼粉)则有利于其形成。
氮源像碳源一样,也有迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源。前者如氨基(或铵)态氮的氨基酸(或硫酸铵等)和玉米浆等,后者如黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等蛋白质。它们各有自己的作用,速效氮源容易被菌体所利用,促进菌体生长,但对某些代谢产物的合成,特别是某些抗生素的合成产生调节作用,影响产量。如抗生链霉菌的竹桃霉素发酵中,采用促进菌体生长的铵盐浓度,能刺激菌丝生长,但抗生素产量下降。铵盐还对柱晶白霉素、螺旋霉素、泰洛星等的合成产生调节作用。缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物的分泌期、提高产物的产量是有好处的。但一次投入,也容易促进菌体生长和养分过早耗尽,以致菌体过早衰老而自溶,从而缩短产物的分泌期。综上所述,对微生物发酵来说,也要选择适当的氮源和适当的浓度。
发酵培养基一般是选用含有快速和慢速利用的混合氮源。如氨基酸发酵用铵盐(硫酸铵或醋酸铵)和黄豆蛋自水解物;链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。但也有使用单一的铵盐或有机氮源(如黄豆饼粉)。它们被利用的情况与快速和慢速利用的碳源情况相同。为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶,除了基础培养基中的氮源外,还要在发酵过程中补加氮源来控制浓度。生产上采用的方法有
1.补加有机氮源
根据产生菌的代谢情况,可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源,如酵母粉、玉米浆、尿素等。如土霉素发酵中,补加酵母粉,可提高发酵单位;青霉素发酵中,后期出现糖利用缓慢、菌浓变稀、pH值下降的现象,补加尿素就可改善这状况并提高发酵单位;氨基酸发酵中,也可补加作为氮源和pH调节剂的尿素。
2.补加无机氮源
补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。氨水既可作为无机氮源,又可调节pH。在抗生素发酵工业中,通氨是提高发酵产量的有效措施,如与其它条件相配合,有的抗生素的发酵单位可提高50%左右。但当pH偏高而又需补氮时,就可补加生理酸性物质的硫酸铵,以达到提高氮含量和调节pH的双重目的。还可补充其它无机氮源,但须根据发酵控制的要求来选择。
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